Ribo-seq 去接头处理常用序列及其来源整理记录

整理日期：2026-06-03

主题：Ribo-seq 数据预处理

1. 背景：为什么 Ribo-seq 数据特别需要去接头

Ribo-seq（ribosome profiling）通过核酸酶消化未被核糖体保护的 RNA，富集核糖体保护片段（ribosome-protected fragments, RPFs），再对这些短片段进行高通量测序，从而在转录组尺度上定位核糖体占据位置和估计翻译状态。常见 RPF 长度通常在约 20–35 nt 范围内，经典真核 elongating ribosome footprint 常见于约 28–30 nt，但具体长度会受到物种、核酸酶、翻译抑制剂、消化强度、片段回收范围和建库方法影响。参考：McGlincy & Ingolia 2017, Methods / PMC、Ribo-seq review 2024 / PMC。

由于 RPF insert 通常明显短于 Illumina SE50、SE75 或更长读长，测序时很容易从 insert 读穿进入 3′ adapter。因此，Ribo-seq 原始 reads 预处理的关键步骤通常包括：

1. 3′ adapter trimming；
2. 低质量碱基过滤；
3. RPF 长度筛选；
4. rRNA/tRNA/snRNA/snoRNA 等污染序列去除；
5. 基因组或转录组比对；
6. P-site/A-site offset 校正；
7. CDS 富集和 3-nt periodicity 检查。

Cutadapt 官方文档说明：当待测片段短于 read length 时，read 会包含 adapter；-a ADAPTER 用于识别并去除 3′ adapter 及其后续序列。参考：Cutadapt user guide。

需要特别注意：Ribo-seq 没有唯一标准 adapter 序列。去接头序列主要由文库构建方案决定。常见来源包括：

• Ingolia-style Ribo-seq 协议；
• NEB Universal miRNA Cloning Linker；
• Illumina TruSeq Small RNA；
• NEBNext Small RNA / NEBNext Multiplex Small RNA；
• NEXTflex、CleanTag、TailorMix、Lexogen 等 small RNA kit；
• QIAseq miRNA Library Kit；
• SMARTer smRNA-seq / poly(A)-tailing 类流程；
• Ribo-ITP 等低输入或单细胞改造流程；
• 项目或实验室自定义 adapter。

2. 常见文库构建试剂盒 / 论文协议与 adapter 来源

2.1 Ingolia-style Ribo-seq / NEB Universal miRNA Cloning Linker

经典 Ribo-seq 协议常把 RPF 当作短 RNA 片段进行建库。RPF 经过末端修复后，在 3′ 端连接一个预腺苷化、3′ 阻断的 linker，然后进行反转录、环化或 PCR 扩增、测序。

NEB Universal miRNA Cloning Linker 的官方序列为：

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5′ rAppCTGTAGGCACCATCAAT–NH2 3′

其中真正会作为 reads 3′ 端 adapter 被 trim 的 DNA 序列是：

1

CTGTAGGCACCATCAAT

参考来源：

• NEB Universal miRNA Cloning Linker, S1315S
• RiboGalaxy Ribo-seq preprocessing tutorial

该序列是 Ribo-seq 中最常见的 adapter 之一。若在 FastQC overrepresented sequences 中看到 CTGTAGGCACCATCAAT、TGTAGGCACCATCAAT 或相关截短片段，通常可以优先怀疑是 NEB/Ingolia-style linker。

2.2 Illumina TruSeq Small RNA / NEXTflex / CleanTag / TailorMix 类 small RNA kit

Ribo-seq 文库的 insert 很短，因此很多实验室直接借用 small RNA library kit。Illumina TruSeq Small RNA 的官方 adapter trimming 序列为：

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TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG

参考来源：

• Illumina TruSeq Small RNA adapter sequences
• adapter4srna：small RNA kit adapter 汇总

NEXTflex、CleanTag、TailorMix 等 small RNA 建库体系也常见同一 TGGA... 系列 adapter。部分 NEXTflex Small RNA 文库还会在 insert 两侧引入 random bases，因此在去除 3′ adapter 后，还可能需要额外裁剪 reads 两端的 4 nt random bases。例如 GEO 样本 GSM4403966 的 Ribo-seq 数据处理记录中，先使用 -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG --minimum-length 23 去接头，再使用 cutadapt -u 4 -u -4 去除两侧 4 nt random bases。参考：GSM4403966 GEO processing record。

2.3 NEBNext Small RNA / NEBNext Multiplex Small RNA

NEBNext Small RNA Library Prep 的官方 FAQ 给出 single-end Read 1 trimming 序列：

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AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

paired-end 数据中，Read 2 可使用：

1

GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT

参考来源：NEB FAQ: How should my NEBNext Small RNA library be trimmed?

实际分析中，还常见使用较短的 Illumina/NEBNext adapter core：

1

AGATCGGAAGAGCACACGTCT

该 core 序列可提高对截短 adapter 的识别，但也更容易与 insert 内部序列发生偶然匹配。因此，未知数据初筛时可以使用，最终流程中建议结合 cutadapt report 和 FastQC 结果决定。

2.4 QIAseq miRNA Library Kit

QIAseq miRNA Library Kit 也可能用于 Ribo-seq 或类似短 RNA 文库。QIAGEN 官方 FAQ 给出的 QIAseq miRNA NGS 3′ adapter 为：

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AACTGTAGGCACCATCAAT

QIAseq miRNA 5′ adapter 的 DNA trimming 序列为：

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GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC

参考来源：

• QIAGEN FAQ-3671: QIAseq miRNA NGS 3′ Adapter
• QIAseq miRNA Library Kit product FAQ

注意：AACTGTAGGCACCATCAAT 与 NEB/Ingolia-style CTGTAGGCACCATCAAT 高度相似。如果在 reads 中观察到 ACTGTAGGCACCA 这类片段，既可能是 QIAseq adapter 的截短片段，也可能是 NEB/Ingolia linker 附近多读入或截断造成的相似片段。建议同时测试完整的 AACTGTAGGCACCATCAAT 与 CTGTAGGCACCATCAAT。

2.5 Lexogen、CATS、SMARTer 等其他 small RNA 建库体系

一些 Ribo-seq 或短 RPF 类数据可能使用其他 small RNA kit。adapter4srna 汇总了多种商业 small RNA kit 的 3′ adapter，例如：

参考来源：adapter4srna GitHub repository

这类序列在 Ribo-seq 中不是最经典方案，但由于 Ribo-seq insert 很短、建库逻辑与 small RNA-seq 相似，因此在未知数据中仍值得检查。

2.6 Ribo-ITP / poly(A)-like adapter / ligation-free 或低输入改造流程

Ribo-ITP（ribosome profiling via isotachophoresis）是低输入或单细胞场景下的改造 Ribo-seq 方法。Ozadam et al. 的 Nature 文章方法部分说明，Ribo-ITP 数据中使用 cutadapt 去除 3′ adapter：

1

AAAAAAAAAACAAAAAAAAAA

而 conventional ribosome profiling 数据中去除 poly(A) tail 的参数为：

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cutadapt -u 3 -a AAAAAAAAAA --overlap=4 --trimmed-only

参考来源：

• Ozadam et al. 2023, Nature: Single-cell quantification of ribosome occupancy in early mouse development
• Ribo-ITP protocol page

这类 poly(A)-like 序列低复杂度较高，最终分析时应谨慎使用，避免对真实 insert 中的 A-rich 区域造成过度修剪。

2.7 较老或项目特异 adapter

部分较早 Ribo-seq 数据或实验室自定义建库方案使用不同 adapter。例如 GEO 样本 GSM1446833 明确标注 ribosome profiling 3′ adapter 为：

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TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG

参考来源：GSM1446833 GEO processing record

还有一些项目会直接把 NEB/Ingolia linker 与下游 Illumina adapter 拼接后作为完整 trim 序列，例如 GEO 样本 GSM5610138 的 Ribo-seq trimming 参数为：

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CTGTAGGCACCATCAATAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC

参考来源：GSM5610138 GEO processing record

这类序列更应视为“项目实例来源”，不宜直接当作所有 Ribo-seq 数据的通用 adapter。

3. Ribo-seq 去接头常用序列汇总表

4. FASTA 格式 adapter 序列

可将以下内容保存为 ribo_adapters.fa，用于 cutadapt 初筛。

>NEB_Universal_miRNA_Cloning_Linker_Ingolia_RiboSeq
CTGTAGGCACCATCAAT
>QIAseq_miRNA_Library_Kit_3prime_adapter
AACTGTAGGCACCATCAAT
>Illumina_TruSeq_Small_RNA_NEXTflex_CleanTag_TailorMix
TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG
>Lexogen_Small_RNA_Seq_3prime_adapter
TGGAATTCTCGGGTGCCAAGGAACTCCAGTCAC
>NEBNext_Small_RNA_Read1_adapter
AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
>Illumina_TruSeq_or_NEBNext_LowBias_Read1_adapter
AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCA
>NEBNext_Small_RNA_3prime_adapter_core
AGATCGGAAGAGCACACGTCT
>Diagenode_CATS_small_RNA_Seq_3prime_adapter
GATCGGAAGAGCACACGTCTG
>CATS_Illumina_short_adapter_residual
AGAGCACACGTCTG
>Old_Illumina_small_RNA_DpnII_gene_expression_adapter
TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG
>Ingolia_RiboSeq_linker_plus_Illumina_adapter_composite
CTGTAGGCACCATCAATAGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC
>PolyA_tailing_SMARTer_smRNA_ligation_free_RiboSeq
AAAAAAAAAA
>Ribo_ITP_3prime_adapter
AAAAAAAAAACAAAAAAAAAA
>Illumina_TruSeq_QIAseq_small_RNA_5prime_adapter
GTTCAGAGTTCTACAGTCCGACGATC
>NEBNext_Small_RNA_paired_end_Read2_adapter
GATCGTCGGACTGTAGAACTCTGAACGTGTAGATCTCGGTGGTCGCCGTATCATT
>Illumina_TruSeq_paired_end_Read2_adapter
AGATCGGAAGAGCGTCGTGTAGGGAAAGAGTGT

5. 未知 Ribo-seq 数据的 cutadapt 操作建议

5.1 优先确认 adapter 来源

对于未知 Ribo-seq 数据，不建议直接固定使用某一个 adapter。推荐按以下顺序确认：

1. 查看原始论文 Methods 中的 library preparation / data processing；
2. 查看 GEO/SRA/ENA 样本页面的 Data processing 或 Library construction 字段；
3. 运行 FastQC 或 fastp，查看 Overrepresented sequences；
4. 将 overrepresented sequences 与上方 adapter FASTA 比对；
5. 使用多个候选 adapter 做 cutadapt 初筛；
6. 根据 cutadapt report 选择主 adapter，再进行正式 trimming。

5.2 使用多个候选 adapter 做初筛

将上方 FASTA 保存为：

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ribo_adapters.fa

对未知样本做初筛：

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cutadapt \
  -j 8 \
  -a file:ribo_adapters.fa \
  -m 15 \
  -o sample.adapter_screen.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.adapter_screen.cutadapt.log

查看每个 adapter 的命中情况：

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grep -A 8 "=== Adapter" sample.adapter_screen.cutadapt.log

如果某个 adapter 的 trimmed reads 占比显著高于其他 adapter，说明它更可能是真实建库 adapter。正式分析时建议只使用该 adapter 或同一建库体系的一组 adapter，避免过度修剪。

5.3 常规 single-end Ribo-seq 去接头示例

NEB / Ingolia-style linker

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cutadapt \
  -j 8 \
  -a CTGTAGGCACCATCAAT \
  -m 20 \
  -M 35 \
  -q 20 \
  -o sample.trimmed.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.cutadapt.log

Illumina TruSeq / NEXTflex small RNA adapter

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cutadapt \
  -j 8 \
  -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG \
  -m 20 \
  -M 40 \
  -q 20 \
  -o sample.trimmed.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.cutadapt.log

NEBNext Small RNA adapter

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cutadapt \
  -j 8 \
  -a AGATCGGAAGAGCACACGTCTGAACTCCAGTCAC \
  -m 20 \
  -M 40 \
  -q 20 \
  -o sample.trimmed.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.cutadapt.log

5.4 NEXTflex random bases 处理示例

如果确认文库为 NEXTflex Small RNA，并且建库设计包含两端 4 nt random bases，可先去 3′ adapter，再去两端 random bases：

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# Step 1: 去除 3′ adapter
cutadapt \
  -j 8 \
  -a TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG \
  -m 23 \
  -o sample.no_adapter.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.adapter.log

# Step 2: 去除两端 4 nt random bases
cutadapt \
  -j 8 \
  -u 4 \
  -u -4 \
  -m 20 \
  -M 40 \
  -o sample.trimmed.fq.gz \
  sample.no_adapter.fq.gz \
  > sample.random_base_trim.log

参考：GSM4403966 GEO processing record。

5.5 Poly(A)-like adapter 的处理建议

对于 AAAAAAAAAA 或 AAAAAAAAAACAAAAAAAAAA 这类 poly(A)-like adapter，应特别谨慎：

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cutadapt \
  -j 8 \
  -a AAAAAAAAAA \
  --overlap 4 \
  --trimmed-only \
  -m 20 \
  -o sample.trimmed.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.polyA_trim.log

Ribo-ITP 示例：

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cutadapt \
  -j 8 \
  -a AAAAAAAAAACAAAAAAAAAA \
  --overlap 4 \
  --trimmed-only \
  -m 20 \
  -o sample.trimmed.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.ribo_itp_trim.log

低复杂度 adapter 容易与真实 insert 中的 A-rich 区域偶然匹配。建议只有在文献、GEO/SRA 记录或 FastQC 明确支持时，才把它作为最终 trimming adapter。

5.6 不建议盲目把所有 adapter 用于最终 trimming

多 adapter trimming 适合做初筛，但不一定适合作为最终流程。特别需要谨慎的序列包括：

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AAAAAAAAAA
AGAGCACACGTCTG
AGATCGGAAGAGCACACGTCT

这些序列较短或低复杂度，可能在真实 RPF insert 中偶然出现。最终 trimming 方案应结合以下 QC 指标判断：

• adapter trim rate 是否合理；
• trim 后 reads 长度峰是否符合实验预期，例如常见 20–35 nt；
• rRNA/tRNA 污染是否下降；
• CDS 区域 reads 是否富集；
• 是否存在明显 3-nt periodicity；
• P-site/A-site offset 是否稳定；
• 生物学重复之间长度分布和周期性是否一致。

6. 推荐的未知 Ribo-seq 数据处理流程

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# Step 1: 原始数据 QC
fastqc sample.raw.fq.gz -o fastqc_raw/

# Step 2: 使用候选 adapter FASTA 做初筛
cutadapt \
  -j 8 \
  -a file:ribo_adapters.fa \
  -m 15 \
  -o sample.adapter_screen.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.adapter_screen.cutadapt.log

# Step 3: 查看 adapter 命中情况
grep -A 8 "=== Adapter" sample.adapter_screen.cutadapt.log

# Step 4: 根据主 adapter 正式 trimming
cutadapt \
  -j 8 \
  -a CTGTAGGCACCATCAAT \
  -m 20 \
  -M 35 \
  -q 20 \
  -o sample.trimmed.fq.gz \
  sample.raw.fq.gz \
  > sample.final.cutadapt.log

# Step 5: trim 后 QC
fastqc sample.trimmed.fq.gz -o fastqc_trimmed/

7. 总结

Ribo-seq 去接头序列应由建库方案决定，而不是由 “Ribo-seq” 这个实验类型唯一决定。最常见的 Ribo-seq 3′ adapter 是 NEB/Ingolia-style CTGTAGGCACCATCAAT；small RNA kit 文库中常见 TGGAATTCTCGGGTGCCAAGG；NEBNext/Illumina 系文库中常见 AGATCGGAAGAGCACACGTCT...；QIAseq 文库中可能出现 AACTGTAGGCACCATCAAT；Ribo-ITP 或 poly(A)-tailing 类流程中可能出现 AAAAAAAAAA 或 AAAAAAAAAACAAAAAAAAAA。

对于未知来源 Ribo-seq 数据，推荐先结合论文 Methods、GEO/SRA 记录、FastQC overrepresented sequence 和 cutadapt 初筛结果确定真实 adapter，再进行正式 trimming。不要直接把所有候选 adapter 同时用于最终分析，尤其要谨慎处理短序列和低复杂度序列。

8. 参考来源

1. NEB Universal miRNA Cloning Linker, S1315S
2. Illumina TruSeq Small RNA adapter sequences
3. NEB FAQ: How should my NEBNext Small RNA library be trimmed?
4. QIAGEN FAQ-3671: QIAseq miRNA NGS 3′ Adapter
5. QIAseq miRNA Library Kit product FAQ
6. adapter4srna: 3′ adapter in small RNA sequencing
7. GSM4403966 GEO record: NEXTflex / TGGA adapter and 4-nt random-base trimming
8. GSM1446833 GEO record: TCGTATGCCGTCTTCTGCTTG Ribo-seq adapter
9. GSM5610138 GEO record: composite Ribo-seq adapter
10. Ozadam et al. 2023, Nature: Single-cell quantification of ribosome occupancy in early mouse development
11. Ribo-ITP protocol page
12. Cutadapt user guide
13. RiboGalaxy Ribo-seq preprocessing tutorial
14. Illumina adapter trimming reference
15. McGlincy & Ingolia 2017: Transcriptome-wide measurement of translation by ribosome profiling
16. A review of ribosome profiling and tools used in Ribo-seq data analysis, 2024

贡献者

数据整理与撰写：ChatGPT-5.5

审校与发布：Cy257

本文由 AI 辅助生成，经作者审校后发布。